该项目执行期2022-2025年,项目拟利用“跨界RNAi介导的棉花种质创新体系”创制抗黄萎病和蚜虫的陆地棉新种质。建立标准化、高效的基于跨界RNAi的陆地棉生物技术育种平台;突破利用基于跨界RNAi技术进行陆地棉抗病虫种质创制的技术壁垒;创制高抗黄萎病和蚜虫的陆地棉种质资源。2022年已经开展的工作有:
1、蚜虫中跨界RNAi靶点的选择与验证
对已知功能的与蚜虫生长发育相关的重要蛋白进行筛选,选择蚜虫中高度保守的蛋白作为候选靶点。利用拟南芥对转化构建及sRNA的产生进行试验性验证,从而明确靶点和构建。
2、基于跨界RNAi技术创制抗蚜虫的陆地棉种质
已经筛选到对蚜虫生长发育相关的基因,选取该基因的有效序列进行设计dsRNA,构建到植物转化载体上,对棉花进行转化。随后对棉花转化体进行筛选,通过田间卡检及实验室PCR的方法对转化体身份进行初步确认,现已得到了5条转化体株系。对筛到的棉花转化体株系进行抗蚜虫的验证,利用蚜虫观测试验对转化体和对照的抗蚜性进行比较,结果发现转化体相对于对照有显著的抗蚜效果;并收集不同植株上的蚜虫,提取RNA,通过Northern检测sRNA的产生情况发现,转化体能够产生目的小RNA。
3、基于跨界RNAi技术陆地棉抗蚜虫的分子生物学理论基础研究
接下来要对转化体进行DNA水平的分子验证,并进行Southern验证来检测外源基因在基因组的插入情况。